IMB205

AKTA PRIME System (FPLC)

1. 簡介

1.1 各部分的名稱：

System pump            Mixer       Sample                  Column    Monitoring      Fractionation

(1) gradient switch valve

控制buffer A和buffer B的混合比，製作梯度

(2) buffer valve

buffer A 有八個閘可供選擇(buffer B只有一個閘)，通常使用port 1，若有大量

的sample要加進column時，可接在port 8 上，由pump直接送液至column

此為系統預定位置，能從電腦上修改。

(3) system pump

流速範圍為0.1~50 ml/min，耐壓1 MPa。

(4) pressure sensor

系統壓力的感測器。若壓力超過method 中所設的壓力限制時，會自動停止送

液，防止column 破損。

(5) mixer

混合buffer A 和buffer B。

(6) injection valve

 

 系統會根據所設的method 自動更換流路。

(7) monitor

UV monitor 是用來偵測蛋白質等所吸收的UV 變化。有280 nm 和254 nm 的光濾鏡。

conductivity 是用來偵測溶液中鹽濃度的變化。

pH(optional)是用來偵測溶液中pH 值的變化。未使用時，pH 電極須放置在保存液

(pH 4 buffer：2 M KNO3 = 1：1 )之中。

(8) flow restrictor

為了防止氣泡進到column 和flow cell 之間，多增加0.2 MPa 壓力的零件。

(9) fraction collector

分配column 的溶出液。

 

2. 基本操作

2.1 控制面板說明

OK：選擇並進入子目錄

Esc：跳出子目錄回到上層

end：結束程式或指令

feed tube：fraction collector 自動對位

hold/cont：程式暫停但pump 持續工作

pause/cont：程式和pump 都暫停

2.2 主要選單

(1) Templates

系統啟動後，最初顯示在螢幕上的選項。內含實驗內建程式

(2) Run Stored Method

可叫出已儲存的Method，可選擇從PC或從System叫出

(3) Manual Run

手動操作系統時使用

(4) Program Method

不使用Template自行編成Method時使用

(5) Copy Method

複製已編成的Method

(6) Set Parameters

輸入有關操作環境的參數時使用

(7) Check

確認電腦的連接時使用

 

3. 系統準備

3.1 系統洗淨

(1) 將去離子水接在B管

(2) 選擇Templates，按OK

(3) 選擇Application Template，按OK

(4) 選擇System Wash Method，按OK

(5) 選擇用來洗淨的管閘(預設是B, A 的順序)，選至OK

(6) 在Press OK to Start Run下按OK後執行Method

(7) 在Method Complete Press OK to complete下按OK確認

3.2 Buffer

(1) 安裝實驗所需的buffer至相對應的A(1, 2, 3, … 8)和B管路

(2) 更換pump內的buffer並趕出氣泡

(3) 與3.1的(2)~(7)步驟相同

3.3 Column

(1) 使用適當的接頭連接column和系統

(2) 選擇Manual Run，按OK

(3) 選擇Set Method Base 後，選至ml，按OK

(4) 選擇Set Concentration %B 後，選至0，按OK

(5) 選擇Set Flow Rate後，選至0.8(視column可以承受壓力而定)，按OK

(6) 選擇Set Buffer Valve Pos後，選至1按OK

(7) 選擇Set Inject Valve Pos 後，選至Load按OK

(8) 選擇Start Run，按OK

(9) 在Press OK to Start Run下按OK後執行

(10) 確定沒有氣泡進入column

3.4 Fraction collector

(1) 放入足夠的收集管

(2) 調整fraction arm到適當的高度

(3) 按控制面板上的feed tube使fraction collector自動對位

3.5 Sample

(1) 將sample打入sample loop (or port 2)，小心氣泡進去

(2) 多打入一點點sample，使整個loop均充滿sample

 

4. 程式編成與實行

4.1 Application Template

內建11種Method及System Wash Method。

(1) 接好column，打入sample

(2) 選擇Templates，按OK

(3) 選擇Application Template，按OK

(4) 選擇所需的Template，按OK

(5) 選擇Sample appl. Volume後，輸入值按OK

(6) 在Press OK to Start Run下按OK後執行

4.2 Method Template

內建4 種：Gel filtration / Buffer exchange

Ion exchange / Gradient elution

HIC / Gradient elution

Affinity / Step Gradient

(1) 接好column，打入sample

(2) 選擇Templates，按OK

(3) 選擇Method Template，按OK

(4) 選擇所需的Template，按OK

(5) sample inject by：選擇InjV or Pump，按OK

InjV：從sample loop，進入

Pump：大量sample從system pump直接進入column

(6) Set Pressure Limit：輸入適當的壓力，執行中若超過此壓力，系統會自動停止

(7) Set Flow Rate：輸入流速

(8) Set Fraction：輸入收集Fraction的容量

(9) Set Equilibr. Volume：平衡column，輸入buffer的量(column體積的5倍)

(10) Set Sample Inj. Volume：輸入加進sample的量

(11) Set Wash 1 Volume：輸入衝洗非吸著物質所需buffer的量(column體積的2~3倍)

(12) Set Elution. Volume：輸入Gradient的體積(column體積的20倍)

(13) Set Wash 2 Volume：Wash 2 是Gradient 到達100%後，洗淨column的量

(column體積的5倍)

(14) Method ready? Press OK：必要項目設定完成後按OK

(15) Save Method：要保存編好的程式時選擇yes 按OK

(16) Free Method：選擇要儲存的位置，(Free)為尚未儲存；(Used)為已儲存

(17) 在Press OK to Start Run下按OK後執行

4.3 Method 編成

(1) column的平衡

(2) sample的加入

(3) 開始用buffer洗淨

(4) gradient開始

(5) gradient結束

(6) column的再平衡或清洗

Program Method (lab最常用的方式)

(1) Set Method Base：brake point 編成的單位設定，選擇time或ml後按OK

(2) Set Fraction Base：選擇time、ml 或drop 後按OK

(3) Set Pressure Limit：輸入適當的壓力，執行中若超過此壓力，系統會自動停

止

(4) Edit Breakpoint：選擇New，按OK。會產生一個新的breakpoint值0.00

(5) 設定breakpoint值，按OK

(6) 輸入各項需要的值(濃度、流速、收集fraction容量等)

(7) Save Breakpoint：按OK，保留新的設定值

(8) End Method，按OK

(9) Save Method：要保存編好的程式時選擇yes，按OK

4.4 Method 複製

(1) Copy Method 按Ok

(2) Copy Method Form? ：選擇想要複製的程式來自System或PC，選完後按OK

(3) 輸入method 的編號按OK

(4) Copy Method To? ：選擇想要複製程式到System或PC，選完後按OK

(5) 輸入method 的編號按OK

Free：未編輯過的程式

Used：已編輯過的程式

(6) Method Occupied：選擇Yes 或No 決定是否要刪除已編輯過的程式

(7) 在Copy Method Press OK 下按OK 後執行

4.5 Method 刪除

(1) Program Method 按OK

(2) Free Methods：選擇想刪除的Method 編號按OK

(3) Free Occupied：選擇clear 按OK

(4) 按OK 確定刪除該程式

 

5. 系統執行完成

5.1 結束系統運作與保養

請將column取出後再執行System Wash Method。

(1) 將column置換為ddH2O或是20%EtOH保存

(2) 執行System Wash Method (參照3.1)將系統中所有管路以ddH2O 沖洗

(3) 三天以上不使用System，則將系統中所有管路以ddH2O 沖洗，再以

20% EtOH 沖洗並保存

(4) 關掉電源(lab規矩是不用關機而要關lamp：Set Parametersàlampàoff)

 

                                                                                                      (完)

 

You can also download this file from: http://hyuan.imb.sinica.edu.tw/protocol/akta_prime.doc

 

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