IMB205

Sample preparation for iTC

(1)樣品的數量估算：

(A)C=n * K_A * M_tot  → M_tot=C * n^-1 * Kd

n: identical binding site. 

M_tot: cell concentration. 

KA: association constant.

(the C-value of good data: 10~500，一般取50估算)

EX: Kd=10^-6M，C=50，所需sample cell concentration(ligand)量估算為:

    M_tot= 50*1*10^-6M = 50uM

   而syringe concentration(analyte) is 10-20 times higher than sample concentration.  

    M_syr =50uM*10=500uM

(B) The volume of sample cell is 280ul(用350ul做一次實驗!)

   The volume of syringe cell is 39ul(用60ul做一次實驗)

→實驗並不是一次就可以成功，最好準備可以做三次以上的量!

(2)樣品的準備

(A) ligand 和analyte的buffer要一樣!!些許不一樣，就會造成DATA的誤判! 強 

  烈建議樣品要透析，然而analyte是小分子或是DNA可以用透析後的buffer 

  配製。

(B)Buffer中含有DTT(不推薦), 2-ME, glycerol有時會影響實驗，不過以蛋白的特

  性為主， 如蛋白缺少這些東西會不穩定，還是先加看看，在看影響的範圍!

(C)樣品必須要穩定，通常以25^oC進行實驗，但是可以降溫例如20^oC或15^oC，   

   但溫度低訊號也會低，取決在反應的反應熱大小。

(3)注意事項：

(A) iTC不適用Kd低於nM的實驗!因為一滴下去可能就馬上飽和了!

(B)Syringe cell的濃度會比較濃，所以那ㄧ個要在sample cell，那ㄧ個要在syringe 

   cell的話，要看那ㄧ個在高濃度的狀態會比較穩定!(ex:protein-protein  

   interaction)

(C)沒有規定那ㄧ個樣品要在sample cell，所以取決在自己的實驗，樣品穩定性， 

   樣品價格...等。

(D)做實驗前，請先測試實驗的物質在反應時是否會沉澱!