Part I: isotope label

(A). Reaction

RNA & DNA 5’ label:

RNA&DNA (10 pmol/ul)  1ul

10x T4 PNK buffer       2ul

T4 PNK                         1ul

p³²ATP                         5ul(2 pmol/ul)

ddH2O                        14ul

total                             20ul

→37℃ 1hr 

→70℃ 15min

 

DNA 3’ label                     RNA 3’ label

DNA (10 pmol/ul)      1ul                        RNA (10 pmol/ul)           1ul

10x Tdt    buffer          2ul                  10x T4 RNA ligase buffer    2ul

Tdt                                1ul                          T4 RNA ligase              1ul

p³²ATP                       5ul                                p³²pCp                    2ul

ddH2O                      14ul                                 ddH2O                   14ul

total                           20ul                                     total                     20ul

→37⁰C 30min or 1hr                      →37⁰C 30min or 1hr

→65⁰C 20min                                 →65⁰C 20min

 

(B). Remove additional free nucleotide with G25 column

 (1) G25 column離心1min 3K(移除多餘的水分)

(2) 將G25 column放置在標示好的eppendorf

(3) 再將步驟(A)的樣品加入至G25 column，並離心 2min 3K

(4) 將column移除，eppendorf 裡即是label成功的DNA或RNA

20% TBE-urea gel

5X TBE                     2.5ml

ddH2O                      2.5ml

urea                         10.6g

40% Acryaminde  12.5ml

TEMED                      25ul

10%APS                   125     

total                           25ml

---

 

Part II: filter binding assay

(A)Material:

1.上層Nitrocellulose membrane(Whatman PROTRAN lot:D105385)

(protein membrane: nucleic acids& protein complex, bound)

2.下層Nylon membrane(Roche lot:16089400)

( nucleic acids membrane: free nucleic acids, unbound)

3. 底層6張 3M paper

4. binding Buffer(low salt!)

5.p32 labeled nucleic acids

6.protein

7.3M paper 一張(20cm*25cm)

(B)原理：

(1)Binding

當我們將蛋白質和DNA混合並加入well裡，當在抽取的過程中，上層的膜會結合蛋白質，所以被蛋白質所結合的DNA會留在上層，下層則會結合沒有被結合的DNA(unbound form)，因此藉此我們可以用不同濃度的蛋白質濃度梯度，計算出DNA被結合的比例進而求出Kd值。

 

(C)procedure:

1. 事先label所需的DNA(RNA)

2. 準備16個不同濃度的protein 45ul(在實驗室內準備)，之後加入5ul的p³² Labeled DNA，要做三次重複。

3.將p³² labeled DNA稀釋100~1000X，然後取5ul的稀釋DNA加入上述(步驟2)準備的蛋白質中(45ul)，在室溫反應20分鐘(最後反應體積為50ul)。

4. 組裝cassette，如下圖，membrane如上述卡通圖組裝方式(上：一張Nitrocellulose，下：一張Nylon，底：6張Paper)，上鎖時，請以對角線方式上鎖

→1. membrane 組裝前先用binding buffer潤濕(六張濾紙不用!)。

5. 將flow valve 接上air pump，轉開開關，吸15sec.

6. 將flow valve轉至半開狀態，將樣品(50ul)依序小心加入至well內。

7. 將flow valve轉至全開狀態，將buffer(100ul)依序小心加入至well內。

8. 拆開cassette，將兩張membrane取出，擺在20cm*25cm的紙上，做記號，並以膠帶固定，再用保鮮膜將整張紙包住，準備壓片

9. 壓片：1. 用image plate壓片12小時

        2. 用底片壓片，請至暗房壓片，然後冰入冰箱12小時。

10 DATA scan and analysis.

注意事項

(1)在蛋白質濃度的取決中，最中間的濃度必須在Kd附近，然而兩端的濃度必須均勻分布（需要有飽和及幾乎沒有結合的點兩點以上），如圖下：
     

(2)Protein 與 DNA之比例

DNA 為定值，但濃度小於蛋白質濃度一千倍以上.

 

---